細胞イメージングの実行のセットアップに何時間も費やし、ショットの途中で焦点が移動したために画像がぼやけていることに気付いたことがある人なら、オートフォーカス (AF) の精度がどれほどイライラするかをご存知でしょう。研究者、生物学者、研究技術者と毎日話している、細胞イメージング システムの分野に何年も携わってきた者として、これだけは言っておきます。AF の精度は単なる技術仕様ではありません。それは、確かなデータを公開することと、1 週間分の実験をやり直すことの違いであり、言うまでもなく、チームが数え切れないほど夜更かしすることもなくなります。今日は、それが実際に何を意味するのか、セルの動作にとってそれが成否を分ける理由、そして最も重要なときにシステムがどのようにスタックするのかを詳しく見てみましょう。
まず、基本を正しく理解しましょう。オートフォーカスの精度とは、イメージング システムがミクロン レベルに至るまでサンプルの焦点面をどれだけ正確にロックできるかということです。細胞の作業にとって、これは思っているよりもはるかに重要です。ほとんどの細胞は 1 ～ 100 ミクロンです。1 ミクロンは人間の髪の毛の太さの約 1/100 であると想像してください。 AF が 2 ミクロンでもずれている場合は、細胞自体ではなく、細胞が置かれているカバーガラスかその上の培地に焦点を合わせていることになります。これは、生細胞のタイムラプス追跡から固定細胞の免疫蛍光に至るまで、わずかな変化でも信号が消えてしまったり、偽陽性が生じたりする可能性があるため、大きな問題となります。
ただし、ここで重要なのは、精度は万能の数値ではないということです。それは、何をイメージングするか、どのようにイメージングするか、研究室の状況によって異なります。たとえば、サンプルが単一の平面ではない 3D スフェロイド内で増殖する生細胞よりも、平らなカバーガラス上の固定細胞に焦点を合わせるのがはるかに簡単です。あるいは、高倍率のイメージング (60 倍や 100 倍の油浸など) を行っている場合、被写界深度は非常に狭く (多くの場合 1 ミクロン未満)、0.5 ミクロンの AF エラーでも画像が壊れてしまいます。そのため、システムについて話すときは、メーカーのマーケティング仕様だけではなく、現実のシナリオでの精度に注目する必要があります。
顧客からよく聞かれる問題点について話しましょう。これは精度の欠陥が実際に現れる場所だからです。最大のものはドリフトであり、熱ドリフトと光学的ドリフトの両方です。数時間にわたるタイムラプスの実行を行う場合、システムのコンポーネント (対物レンズ、ステージ、カメラなど) がウォームアップし、焦点面がわずかに移動して、10 時間目までに細胞がぼやけることがあります。お客様からは、古いシステムでは 24 時間のタイムラプスで 5 ～ 10 ミクロンのずれが発生するため、実行を停止して手動で焦点を合わせ直す必要があり、試薬とデータの分析に費やすことができた時間が無駄になるとの報告がありました。もう 1 つの重要な点は、予算システムで最も一般的な方法であるコントラスト ベースのオートフォーカスです。コントラスト AF は、画像内の最も鮮明なエッジを探すことによって機能しますが、サンプルが薄暗い場合 (低発現の蛍光タンパク質など)、またはバックグラウンド ノイズが多い場合、間違ったスポット (細胞ではなくカバーガラス上の破片の斑点など) にロックされる可能性があります。この点では位相コントラスト AF の方が優れていますが、3D 培養物やオルガノイドなどの凹凸のあるサンプル表面には依然として問題があります。
ここで、システムの背後にある技術が大きな違いを生みます。エントリーレベルの細胞イメージング システムの多くは、工場で一度校正されるだけで、実際の実験室の条件に合わせて調整されることのない基本的なコントラスト AF を使用しています。しかし、私たちはこうした厄介な現実世界のシナリオを処理できるようにシステムを構築してきたため、AF テクノロジーの改良に非常に多くの時間を費やしてきました。ライブサンプルを扱う人にとって、適切なシステムはフォーカスを一度ロックするだけでなく、常に適応する必要があります。そのため、私たちは位相検出とリアルタイム フィードバックを組み合わせた技術に投資し、長時間の実行のために特別に設計されたシステム、Live Cell Imaging System を用意しました。分裂する細胞、神経ネットワーク、または数時間にわたって形状が変化するもののタイムラプス撮影を行う場合、このシステムの AF は、開始時だけでなく数秒ごとに焦点面を追跡するように調整されます。対物レンズの温度をリアルタイムで監視することで、熱ドリフトを自動的に調整します。そのため、レンズが少しでも温まると、気付かないうちに焦点が微調整されます。
待ってください、はっきりさせておきますが、精度の数値はユースケースによって異なり、私たちは単にランダムなミクロン仕様を放り出すわけではありません。たとえば、40 倍または 60 倍の対物レンズで固定細胞をイメージングする場合、当社の AF 精度は、96 ウェル プレート全体であっても一貫して 1 ミクロン未満です。高倍率 100 倍の場合、その厚さは約 0.7 ミクロンであり、微絨毛や個々のシナプスなどの詳細を捉えるのに十分な大きさです。 24 時間にわたる生細胞のタイムラプス実行では、2 ミクロン未満のドリフトを測定します。これは、ほとんどの低価格システムでは近づけることができません。しかし、ここに問題があります。精度が遅ければ役に立たないのです。 AF がロックオンするまでに 2 秒かかる場合は、ウェル間の時間を無駄にしていることになります。さらに悪いことに、細胞分裂などの動的なイベントを見逃していることになります。当社のシステムはこれを 500 ミリ秒未満で実行します。これは、マルチウェル プレートや免疫細胞の移動などの高速に移動する細胞に対しても十分な速さです。
ほとんどの人が語らないもう 1 つの領域は、インテリジェント スキャンと、それが AF の精度にどのように関係するかです。回転楕円体やオルガノイドなどの 3D サンプルをイメージングしている場合、単一の平面に焦点を合わせるだけでは済みません。Z スタックを取得し、各 Z スライスに正確に焦点を合わせる必要があります。そこで当社のライブセル インテリジェント スキャニング システムが登場します。このシステムは、マッピング アルゴリズムを使用してサンプルを事前スキャンし、最適な焦点面を特定し、各 Z スライスの AF を自動的に調整します。セルがスタック内のどこにあるかを推測したり、中央のスライスがぼやけたりする必要はもうありません。私たちは最近、癌のスフェロイド浸潤を研究している顧客とともにこれをテストしました。彼らの古いシステムでは、スフェロイド内の細胞層の 30% が欠落していましたが、私たちのシステムでは、エラー率は 5% 未満でした。これは、仕様書を満たすだけでなく、実際に研究を前進させるような精度です。
また、よくある誤解についても触れておきます。解像度が高いほど AF 精度が向上することを意味しますが、これらは同じではなく関連しています。解像度はどれだけ細部まで見えるかということであり、AF の精度は正しい焦点面にどれだけ正確に到達できるかということです。超高解像度のカメラを使用することはできますが、AF が 2 ミクロンずれている場合は、どうやってもその解像度を得ることができません。カメラをアップグレードしても古いシステムの AF にこだわり続けるお客様に、このような状況がよく見られます。より良いカメラを使用しても、画像が依然としてぼやけて見えるため、最終的に失望してしまいます。だからこそ私たちは、細胞イメージング システムを選択する際に、AF を後付けではなく、中核的なコンポーネントとして考慮するように常に人々に伝えています。
人的要因についてはどうですか？サンプルが正しく準備されていない場合、最も正確な AF システムでも問題が発生しますが、それは当然のことです。カバーガラスが汚れていたり、播種密度が不均一であったり、メディア内の気泡があると、AF システムが正常に機能しなくなる可能性があります。しかし、優れたシステムには、背景ノイズやゴミの多いエリアをスキップする AF アルゴリズムなど、それらをフィルタリングするためのチェック機能が組み込まれているため、間違った場所にロックされることはありません。私たちはそのアルゴリズムを数千回の実行にわたって校正してきたので、実際の細胞と塵の斑点の違いを見分けることができるようになり、プレート全体を再イメージングする必要がなくなります。
現実世界のデータについても触れておく必要があります。紙に書かれた数字は、実験室で通用しない限り何の意味もありません。昨年、私たちは心筋細胞に分化する人工多能性幹細胞（iPSC）を画像化する大学の幹細胞研究室のチームと協力しました。彼らの古いシステムには 3 ～ 4 ミクロンの AF 誤差があり、72 時間以上鼓動する細胞を追跡することが不可能でした。1 時間ごとに焦点を合わせ直す必要があり、生きている細胞が破壊されてしまいました。当社の Live Cell Imaging System に切り替えた後、AF 精度は 72 時間にわたって 1.5 ミクロン未満となり、手動介入なしで細胞拍動速度に関する継続的なデータを取得することができました。これは、優れた AF 精度が技術的な仕様だけでなく、実際の研究に与える影響と同じです。
別の例: ハイコンテンツ スクリーニングでは、1 回の実行で数百のウェルをイメージングします。 AF がウェル間で一貫していない場合、焦点がウェル間で移動するため、最初のプレートからは良いデータが得られ、10 番目のプレートからは悪いデータが得られる可能性があります。当社のシステムには、イメージング前にすべてのウェルでクイックフォーカスチェックを実行し、ウェルの底やサンプル位置の小さな違いを調整するキャリブレーション機能が備わっているため、プレート全体で精度が一貫しています。これは、すべてのウェルからの信頼できる再現可能なデータが必要な薬物スクリーニングにとっては大きな問題です。1 つのウェルに問題があると、スクリーニング全体の結果が歪む可能性があります。
ここで、実際に AF の精度を自分でテストする方法について話しましょう。それは、私たちの言葉をそのまま信じるのではなく、システムを購入する前に行うべきことだからです。ここに簡単なヒントがあります。カバーガラスに取り付けられた標準解像度のターゲット (USAF 1951 ターゲットなど) を使用し、さまざまな位置でイメージ化します。実際のシャープな位置とシステムがシャープであると判断する位置との差が AF エラーです。ただし、これは実際の実行に一致する条件で行ってください。蛍光タンパク質を使用して生細胞の作業を行っている場合は、システムが AF に使用するものであるため、明視野ターゲットだけでなく蛍光解像度ターゲットを使用してください。また、時間をかけてテストします。24 時間のタイムラプスを実行してドリフトをチェックします。これは、精度が最も低下する時期であるためです。
ぼやけた画像、実験のやり直しによる時間の無駄、データの一貫性のなさにうんざりしている場合は、AF 精度が標準以下であることに満足する必要はありません。当社のシステムは、単なるマーケティング仕様ではなく、実際のラボのニーズを念頭に置いて構築されています。固定細胞イメージング、生細胞の長期タイムラプス撮影、ハイコンテンツ スクリーニング、または 3D サンプル イメージングのいずれを行っている場合でも、必要な場所に焦点を固定し続けるために調整された技術が用意されています。 Live Cell Imaging System はダイナミックな長時間の実行に最適であり、Live Cell Intelligent Scanning System は正確な自動 AF により複雑なサンプルのスキャン作業を軽減します。
ぼやけた画像を扱うのをやめて、信頼性の高い再現可能なデータを取得する準備ができている場合は、ぜひチャットしてください。お客様の具体的な実験について話したり、お客様の研究室で当社のシステムをテストしたり、当社の AF 精度がお客様の研究にどのような変化をもたらすかを確認するには、当社にお問い合わせください。当社は画一的なソリューションを提供するわけではないため、お客様のニーズに合ったシステムを見つけるためにお客様と協力し、その逆ではありません。
参考文献
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- 国際サイトメトリー推進協会。 （2020年）。ハイコンテンツ細胞イメージングにおけるオートフォーカスのベスト プラクティス。サイトメトリー パート A、97(11)、1089-1101。
