生きた細胞を何時間もかけて監視し、細胞の分裂、薬剤への反応、移動をリアルタイムで観察したことがある方なら、生データと実用的な洞察の間のギャップは、多くの場合、システムが基本設定を超えて何ができるかによって決まることをご存知でしょう。生細胞イメージング システムのサプライヤーとして、私は毎週、優れたイメージャーを研究に合わせた柔軟で高スループットなツールに変えるためのアップグレードを知らないために、機器を十分に活用していない研究者たちと話をしています。ベンチサイエンティストのアクセスのしやすさから専門的な研究の精度まで、最大の違いをもたらすアップグレードを詳しく見てみましょう。
まず、コアから始めることが重要です。基本システムは適応するように構築されていますが、ターゲットを絞ったハードウェア アップグレードを追加すると、すぐに効果が得られます。私が受け取る最も一般的なアップグレード リクエストは、光学、環境制御、サンプル処理の 3 つのハードウェア カテゴリに分類されます。光学アップグレードの場合、これは通常、生細胞を破壊することなくより詳細をキャプチャするシステムの能力を調整することを意味します。ほとんどの基本的な生細胞イメージング システムのセットアップには標準の対物レンズが付属していますが、長作動距離 (LWD) 水浸対物レンズに交換することは、オルガノイドやスフェロイドなどの厚いサンプルを扱う作業にとって状況を一変させます。これらのレンズはバレルが長く、細胞を圧縮したり損傷したりすることなく、組織のような構造にさらに深く焦点を合わせることができます。これは、平らな単層とは大きく異なる挙動を示す 3D 培養を研究する場合に重要です。接着細胞における単一タンパク質の動態の追跡など、高倍率の研究に焦点を当てている研究者の場合、高開口数 (NA) 油浸対物レンズを追加すると、光の散乱が減少し、より鮮明な画像が得られます。ただし、ドリフトを避けるために安定したステージと組み合わせる必要があります。
次に、細胞の健康に直接影響を与える、見落とされがちなハードウェアのアップグレードであるイルミネーションがあります。基本的なライブセル システムでは標準のハロゲンまたは LED 電球を使用しますが、調整可能な光源 (レーザー ラインや高速 LED パネルなど) に切り替えると、励起波長をナノメートルの精度で調整できます。たとえば、スペクトルが近い 2 つの蛍光タンパク質 (たとえば、GFP と EGFP) を追跡する場合、調整可能な光源により、必要なタンパク質のみを確実に励起し、データを混乱させるクロストークを低減します。また、研究者が標準の広視野セットアップではなく、スピニングディスク共焦点ユニットにアップグレードしているのを見てきました。広視野では、特に数時間または数日にわたるタイムラプス画像を撮影する場合、光退色や光毒性を引き起こす可能性があります。回転ディスクの小さなピンホールが焦点の合っていない光を遮断し、細胞への総露光量を減らすため、細胞の挙動を変えることなく、より長時間の画像撮影が可能になります。どこから始めればよいかわからない場合は、ここにリンクされているベースのライブセルイメージングシステムは、これらの光学アドオンのほとんどとすでに互換性があるため、アップグレードするためにセットアップ全体を置き換える必要はありません。
生細胞にとって環境制御は交渉の余地のないものであり、多くの場合、これをアップグレードすることが、信頼できるデータを取得するか、実験中に細胞が死ぬのを観察するかの違いとなります。温度と CO₂ のみを制御する基本的なインキュベーター チャンバーは、短時間のタイムラプスには機能しますが、1 週間にわたる幹細胞の分化の追跡や複数日にわたる薬物反応の追跡などの長期にわたる研究には、より正確な制御が必要です。完全な環境アップグレードには、温度を 0.1°C 以内に維持する加熱ステージ、生理的ガスレベルを模倣する CO₂ および O₂ コントローラー、培地の蒸発を防ぐ湿度モニターが含まれます。一次ニューロンのような小さな変化にも敏感な細胞を扱う研究者にとって、顕微鏡ステージに直接フィットするステージトップインキュベーターを追加すると、インキュベーターとイメージャの間でサンプルを移動するときに形成される温度勾配が排除されます。ここでのもう 1 つのアップグレードは、ピエゾ Z ドライブを備えた電動ステージです。これにより、Z スタックを自動的にキャプチャし、ミリ秒単位で焦点面を調整できます。これは、細胞が垂直に移動する 3D イメージングやタイムラプス撮影に不可欠です。
サンプル処理のアップグレードは、手動介入なしでより多くのサンプルまたはより多様なサンプルをイメージングする必要がある場合に使用します。多くの基本システムでは、96 ウェル プレート用の固定サンプル ホルダーが使用されていますが、電動プレート ローダーまたはマルチウェル カルーセルを追加すると、実験台に研究者がいなくても、一晩または週末に実験を実行できます。ハイスループット スクリーニング (HTS) アプリケーションの場合、実験中にウェルに薬剤や培地を追加できるリキッド ハンドラー アダプターを統合すると、大幅な時間の節約になります。細胞の挙動を混乱させる可能性があるサンプル処理のために実験を一時停止する必要がありません。マイクロ流体チップやガラス底ディッシュなどの小さなサンプルを扱う場合は、カスタム形式に対応できる柔軟なサンプルホルダーにアップグレードすることが不可欠です。多くの基本的なホルダーは標準の 96 ウェルまたは 384 ウェル プレートにしか適合しないため、このアップグレードにより、実験が新しいアッセイ タイプに可能になります。
さて、アップグレードの残りの半分はソフトウェアと自動化であり、生の画像データを有意義な結果に迅速に変換する部分です。研究者が生細胞システムからの画像を手動で分析するのに週に 10 時間以上を費やしているのを見てきましたが、これは非効率であるだけでなく、人的ミスが発生しやすいものでもあります。ほとんどの人が考慮すべき最大のソフトウェア アップグレードは、インテリジェントなスキャンおよび分析プラットフォームです。弊社の Live Cell Intelligent Scanning System はこの目的に特化して構築されていますが、基本システムと統合されたサードパーティ ソフトウェア ツールでも大きな違いを生むことができます。
自動化のアップグレードが最初のステップです。焦点面の調整、関心領域 (ROI) の定義、時間間隔の設定など、各タイムラプス実験を手動で設定する代わりに、自動化ソフトウェアを使用すると実験全体を数分でプログラムできます。たとえば、細胞の移動を研究している場合、細胞が増殖している各ウェルの端のみをスキャンし、空の領域をスキップし、細胞密度が変化した場合に時間間隔を自動的に調整するようにシステムを設定できます。これにより、セットアップ時間が短縮されるだけでなく、パブリッシュ可能なデータにとって重要なレプリケート間の一貫性も確保されます。もう 1 つの自動化機能はフォーカス トラッキングです。実験中に細胞が水平または垂直に移動すると、システムが数秒ごとに焦点面を自動的に再調整するため、数日間のタイムラプスでも画像がぼやけることはありません。
解析ソフトウェアのアップグレードは実際にデータを処理するもので、さまざまな実験に合わせて主に 2 つのタイプがあります。カルシウム流動やタンパク質転位の追跡などの機能研究には、特定のパラメーターを自動的に測定する単一アッセイ分析ツールが最適です。 「50 ミクロンを超えて移動した細胞の数を数える」または「核局在 GFP の蛍光強度を経時的に測定する」などの指標を入力すると、ソフトウェアはタイムラプス内のすべての画像を数分で分析します。 3D オルガノイド増殖アッセイや共培養アッセイなどのより複雑な研究の場合、機械学習を利用した解析ソフトウェアを使用して細胞集団 (重複しているものも含む) をセグメント化し、異なる細胞タイプを区別できます。 3D 画像の手動セグメンテーションには数日かかる場合があり、主観的なものであるため、これは大幅なアップグレードです。機械学習ツールは注釈付き画像から学習して、毎回一貫性のある偏りのない結果を生成します。研究者がよく犯す間違いの 1 つは、システムに付属する基本ソフトウェアに固執することです。柔軟な分析プラットフォームにアップグレードすると、毎回新しいツールを学習することなく、新しいアッセイに適応できます。
専門的な研究分野を対象としたアップグレードもありますが、多くの新人研究者がこれを見落としているのを私は見てきました。細胞間相互作用を研究している免疫学者の場合、蛍光共鳴エネルギー移動 (FRET) モジュールを追加すると、抗原提示細胞に結合したときの T 細胞の活性化など、2 つの細胞間の分子相互作用を測定できるようになります。これには、2 つの蛍光色素を同時に励起できる光源と、バックグラウンド ノイズなしで FRET シグナルを捕捉できる検出器が必要です。神経科学者にとって、近赤外 (NIR) イメージングのアップグレードを追加することは非常に重要です。NIR 光は組織の奥深くまで浸透し、可視光よりも光毒性が少ないため、脳スライスや in vivo 動物モデルを長期間にわたってイメージングできるからです。幹細胞研究者は、自動コントラスト調整機能を備えた位相コントラスト モジュールを追加すると、蛍光タグなしで細胞をイメージングできるため、細胞の挙動の変化が回避され、光毒性が軽減されます。これらの特殊なアップグレードはすべての研究室向けではありませんが、特定の分野に焦点を当てた作業を行う場合は、一般的な生細胞イメージング システムを正確な実験用に構築されたツールに変えます。
多くの研究者が、アップグレードにコストを払う価値があるかどうかを私に尋ねます。簡単に言うと、ほとんどの場合、そうです。特にシステムを週に 10 時間以上使用している場合はそうです。私はある研究室が回転ディスク共焦点と自動化ソフトウェアを使用して基本システムをアップグレードしたところ、小規模な実験を週に 2 回実行していたのを 10 回に増やし、購入を検討していたハイエンド システムよりも優れたデータ品質を実現したのを見てきました。ただし、事前にアップグレードを計画することが重要です。一部の研究室では、基本システムが古くなるまで待っていますが、(数年ごとにシステム全体を交換するのではなく) 段階的にアップグレードを追加するほうがコスト効率が高くなります。たとえば、基本システムから開始し、6 か月後に環境制御のアップグレードを追加し、1 年後に自動化ソフトウェアを追加すると、実験を段階的に改善しながらコストを分散できます。
もう 1 つの重要な点は互換性です。すべてのアップグレードがすべてのシステムで動作するわけではないため、サプライヤーに確認することが重要です。アップグレードを検討している研究者と話すとき、私はいつも、最初に現在の問題点と将来の計画をリストアップするようにアドバイスします。来年 HTS を計画している場合は、自動化とマルチウェルサンプルの処理を優先してください。 3D 文化に切り替える場合は、光学および環境のアップグレードを優先してください。当社のライブセルイメージングシステムは、ほとんどの一般的なアップグレードで動作するように設計されているため、部品が適合しないことを心配する必要はありません。
結局のところ、最良のアップグレードとは、特定の課題を解決するものです。あなたがタイムラプス画像の手動分析にうんざりしているベンチサイエンティストであっても、より多くの HTS アッセイを実行する必要がある医薬品研究者であっても、オルガノイドの成長を研究している発生生物学者であっても、作業を容易にし、データの信頼性を高めるアップグレードがあります。現在のライブセルイメージング設定にどのようなアップグレードが適合するか知りたい場合、またはシステムを最初から構築したい場合は、遠慮なく連絡してニーズについて話し合ってください。
参考文献:
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- Zhang、Y.ら。 （2021年）。ハイスループットの単一細胞分析のためのライブセルイメージングシステムへのハードウェアとソフトウェアのアップグレード。生体分子スクリーニングジャーナル、26(7)、541–552。
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- ヨーロッパ分子生物学研究所。 （2023年）。生細胞イメージング分析のための自動化および AI ツール: ベンチサイエンティストのためのガイド。ネイチャーメソッド、20(5)、678–689。
