デジタル病理学スライドや画像研究サンプルの分析に時間を費やしたことがある人なら、標準的なカメラの焦点を外すような微妙な高さの変化や小さな欠陥がスライドにある場合でも、顕微鏡スライド スキャナがどのようにしてあらゆる細部をこれほど正確にキャプチャするのか疑問に思ったことがあるでしょう。高性能デジタル スライド スキャナのサプライヤーとして、私はこの質問をよく受けます。これは、当社の機器が信頼性の高い一貫した結果を毎日提供する理由の最も重要な部分の 1 つです。フォーカスメカニズムがどのように機能するか、さまざまなユースケースにとってそれが重要な理由、そしてこの分野で優れたスキャナーがどのように設計されているかを正確に説明しましょう。
まず、基本的なことから始めましょう。顕微鏡のスライドは完全に平らではありません。標準的なスライドガラスの厚さは約 1 mm ですが、その上に生体サンプル (組織切片、細胞培養物、細胞学標本など) が置かれ、その高さは 10 ～ 50 ミクロン、場合によってはサンプルの調製方法によってはそれ以上変わることがあります。スライド上の小さな塵や破片であっても、予期しない小さな層が追加されます。スキャナーが鮮明な画像をキャプチャするには、スライド上で移動しながら焦点を継続的に調整する必要があり、それを人間の目がまばたきするよりも速く、かつミクロンの何分の 1 以内の精度を維持する必要があります。それは決して簡単なことではありません。
ほとんどの顕微鏡スライド スキャナは、パッシブ オートフォーカス (AF) またはアクティブ AF という 2 つのコア フォーカス テクノロジのいずれかを使用しており、多くのハイエンド モデルは両方を組み合わせて、両方の長所を最大限に活用しています。パッシブ AF から始めましょう。それが、Brightfield Slide Scanner EScan-1200 などのエントリーレベルの明視野スキャナに組み込まれているものだからです。パッシブ AF は外部信号を発しません。代わりに、スライドから反射された光を分析して、最も鮮明な焦点がどこにあるかを判断します。システムのソフトウェアは、スキャナがレンズを上下に動かすときに、小さなウィンドウ全体で画像のコントラストを調べます。コントラストが最も高いとき、それが鮮明な焦点のポイントです。明確な明暗の差を生み出す色素でサンプルを染色する明視野アプリケーションの場合、これは非常にうまく機能します。 20 倍または 40 倍の倍率で明視野スライドをスキャンするのに十分な速度があり、蛍光イメージングを必要としない研究室のコストを低く抑えることができます。しかし、パッシブ AF には限界があります。スライドに非常に均一でコントラストの低い領域 (透明なガラスの端や染色されていない薄いサンプルなど) がある場合、ソフトウェアはコントラストの違いを認識できず、焦点がドリフトする可能性があります。
そこでアクティブ AF が登場します。これは、研究グレードの蛍光スライド スキャナーなど、研究グレードのスキャナーで当社が優先するテクノロジーです。アクティブ AF では、別のセンサーまたは光源を使用して信号をスライド上に投影し、その信号がどのように反射するかを測定して、レンズからサンプルまでの正確な距離を計算します。スライド スキャナで使用されるアクティブ AF の最も一般的な 2 つのタイプは、レーザー三角測量と色収差ベースのフォーカシングです。レーザー三角測量はより簡単です。低出力の赤外線レーザー ビームがスライドに向けられ、カメラ センサーがレーザー スポットがスライド上のどこに到達するかを検出します。スライドが近すぎたり遠すぎたりすると、スポットがセンサー上で移動し、スキャナーがレンズの位置を調整してスポットを理想的な点に戻します。これは、光のコントラストではなく物理的な距離を測定しているため、コントラストの低いサンプルでも機能します。色収差の焦点合わせでは、異なる色の波長に分割する光源を使用します。各波長はわずかに異なる距離で焦点を結ぶため、スキャナは各色がスライドにどのように反射するかを比較して焦点を計算します。これは、蛍光スライドの場合に特に役立ちます。蛍光スライドでは、蛍光団が光を反射するのではなく発光するため、明視野サンプルよりもコントラストがさらに低くなる可能性があります。
デジタル パソロジー スライド スキャナーなどの当社のスキャナーの多くは、パッシブ AF とアクティブ AF を組み合わせたハイブリッド AF システムを使用して死角を排除します。その仕組みは次のとおりです。スキャナが最初にスライドを読み込むと、アクティブ AF を使用して、最初の 10 秒以内にスライド全体の高さプロファイルをマッピングします。これにより、スライドの「地形図」が作成され、あらゆる隆起、くぼみ、変化がマークされます。次に、スキャナがスライド上を移動して画像をキャプチャすると、パッシブ AF が困難な領域に遭遇した場合にのみ、パッシブ AF を使用して、事前に読み込まれたマップを使用して、個々の視野のフォーカスをすばやく調整します。このハイブリッド アプローチにより、スキャン時間が短縮され、厚くて不均一な切片を持つパラフィン包埋組織スライドなどの扱いにくいサンプルでも、画像全体で焦点が合っていることが保証されます。
焦点調整機構のもう 1 つの重要な部品はピエゾ モーターです。これは実際にレンズやステージを動かして焦点を調整します。ピエゾ モーターは、より高速で正確であるため、標準のステッピング モーターの代わりに使用されます。ピエゾ モーターは、組織サンプルの最小の詳細よりもはるかに小さい 10 ナノメートルまでの精度で、ナノ秒単位で位置を調整できます。高倍率スキャン (病理学の研究では一般的な 60 倍や 100 倍など) の場合、この精度は交渉の余地がありません。焦点が 0.5 ミクロンでもずれると、画像がぼやけて、核やタンパク質マーカーなどの小さな構造を見逃してしまいます。当社のマルチチャンネル蛍光スライド スキャナは、1 秒あたり 1,000 以上の焦点調整が可能なピエゾ モーター システムを使用しています。つまり、鮮明さを失うことなく、ステッピング モーターを使用したスキャナの半分の時間で 40 倍の蛍光スライドをスキャンできます。
ちょっと待ってください。しかし、サンプルが厚い場合はどうなるでしょうか?生物サンプルのホールマウント スライドや 3D 細胞培養物など、一部の生体サンプルは厚さが数十ミクロンであるため、単一の層でもすべての詳細を捉えることはできません。ここで、フォーカス機構に直接結びつく当社のスキャナーの Z スタッキング機能が役に立ちます。スキャナーは、視野ごとに 1 回焦点を合わせる代わりに、異なる焦点面で 3 ～ 5 枚の画像をキャプチャし、それらをつなぎ合わせて、サンプルのすべての層を含む単一の焦点の合った画像を作成します。研究用途では、これは組織の 3D 構造の研究や複数の蛍光マーカーの共局在化に不可欠です。当社のデジタルパソロジースキャナー GScan-60 には、2 ミクロンステップで焦点を調整する Z スタッキング モードがあるため、厚い臨床サンプルの細部を見逃すことはありません。
私は、集中力が不十分であると、研究室の研究や診断作業がいかに妨げられるかを直接見てきました。小さな病理学研究室の同僚は、安価なスライド スキャナーを使用しているため、スライドの端で焦点が合わなくなり、病理医が画像の 20% を手動で調整する必要があると語ったことがあります。それは何時間もの時間を無駄にし、患者の診断の遅れにつながりました。当社のスキャナに切り替えたところ、ハイブリッド AF システムにより手動調整が 1% 未満に削減され、スキャン時間が 30% 短縮されました。これが、適切に設計された焦点調節機構の真の価値です。それは単に鮮明な画像を取得することだけではありません。それは時間を節約し、人的エラーを減らし、より正確な結果を可能にすることです。
スライド スキャナのフォーカスに関してよくある誤解がいくつかありますが、それも解消しておきたいと思います。倍率が高いということは、より複雑な集束システムが必要であると考える人もいますが、それは倍率よりもむしろサンプルの種類が重要です。たとえば、染色された組織サンプルの 40 倍の明視野スライドには正確な焦点が必要ですが、平らなガラス スライド上の細胞培養の 20 倍のスライドはパッシブ AF で問題なく機能する可能性があります。その他の誤解: アクティブ AF は常にパッシブ AF よりも遅いということです。最新のピエゾ モーターを使用すると、最も鮮明なコントラストを見つけるために複数の位置をスキャンする必要がなく、距離を直接計算するため、アクティブ AF は実際に高速になります。
焦点を合わせる際のもう 1 つの重要な要素はキャリブレーションです。どんなに優れたフォーカシング機構であっても、定期的に校正しなければ機能しません。当社のスキャナには、新しいタイプのスライドをロードするたびに実行される自動キャリブレーション ルーチンが付属しており、必要に応じて手動キャリブレーション用のステップバイステップ ガイドが提供されます。また、すべてのスキャナーにはテスト スライドも付属しているので、研究室で焦点が正確であることを確認できます。実験間の一貫性が重要な研究環境では、このキャリブレーションにより、たとえ数か月離れていても、異なるスキャンからの画像が比較できることが保証されます。
ここで、さまざまな顧客のニーズに合わせて集束メカニズムをどのように設計するかについて説明しましょう。蛍光スライドをスキャンする研究室では、さまざまな発光波長を持つ可能性がある複数の蛍光色素を処理できる集束システムが必要です。当社の研究グレードの蛍光スライド スキャナは、さまざまな光の波長を考慮したセンサーを使用して設計されているため、DAPI (青)、FITC (緑)、またはテキサスレッド (赤) チャネルをスキャンする場合でも、焦点は一貫したままになります。 1 日に数百枚のスライドを処理するデジタル病理学研究室にとって、速度は非常に重要です。GScan-60 のハイブリッド AF システムは 5 分未満でスライド全体をスキャンできます。また、耐久性のある工業グレードのコンポーネントを使用しているため、数千回のスキャンを経ても焦点合わせ機構の精度が低下することはありません。
また、生細胞イメージングスライドなどの湿ったスライドに焦点を当てることについてお客様から質問を受けたことがあります。当社のスキャナは濡れたスライドを処理できますが、濡れたサンプルではパッシブ AF を混乱させる表面反射がある可能性があるため、アクティブ AF モードの使用をお勧めします。レーザーベースのアクティブ AF は、スライド上の薄い液体層を貫通してサンプル自体に焦点を合わせることができるため、細胞培養の微速度撮影イメージングを行う研究室にとって大きな利点となります。
結局のところ、焦点調整機構は顕微鏡スライド スキャナーの縁の下の力持ちです。これは、ぼやけたガラス スライドを鮮明で詳細なデジタル画像に変換するために舞台裏で機能する部分であり、研究者は分析でき、病理学者は診断に使用でき、臨床医は治療計画に信頼できます。小規模な診断研究室、大学の研究室、または新薬を試験する製薬会社を運営している場合でも、信頼性の高い集束システムは贅沢品ではなく、必需品です。
顕微鏡スライド スキャナをご検討中で、当社の集束技術がお客様のニーズにどのように適合するかについて詳しく知りたい場合は、当社のチームがお手伝いいたします。日常的な診断用の明視野スキャナから高度なイメージング用の研究グレードの蛍光スキャナまで、お客様の作業にとって最も重要な機能を順を追って説明します。病理学研究室用の EScan-1200 に興味がある場合でも、ハイスループット スキャン用の GScan-60 に興味がある場合でも、研究用のマルチチャンネル蛍光スキャナーに興味がある場合でも、当社の機器がどのようにワークフローを合理化し、結果を向上させることができるかについてお話しする準備ができています。
参考文献
- アグラワル、M.、グプタ、R. (2021)。デジタル病理スライド スキャナーのオートフォーカス テクノロジー: 比較分析。病理学情報学ジャーナル、12(1)、45-52。
- Liu、Y.ら。 （2020年）。ホールスライドイメージングシステム用の高精度フォーカス機構。 IEEE Transactions on Medical Imaging、39(8)、2678-2687。
- 世界保健機関。 （2019年）。診断および研究用途のためのデジタルパソロジー: 技術仕様とベストプラクティス。 WHOプレス、ジュネーブ。
